3.1. Procedimiento

3.1.1. Principios biológicos

En el ELISA ABBOTT HIV-1/HIV-2 EIA PLUS DE TERCERA GENERACIÓN, el suero o plasma humanos se diluye con diluyente de muestra y se incuba con una esfera de poliestireno recubierta de las proteínas recombinantes env y gag del VIH-1 y env del VIH-2. Si los   anticuerpos   frente al VIH están presentes en la muestra, estos reaccionan con los antígenos que recubren las esferas. Después de la aspiración de los materiales no unidos y del lavado de las esferas, las inmunoglobulinas humanas específicas que han quedado unidas a la fase sólida se detectan incubando el complejo esfera-antígeno-anticuerpo con una solución que contiene las proteínas recombinantes gag y env del VIH-1 y la proteína recombinante env del VIH-2 y un péptido sintético del env del VIH-1 marcado con peroxidasa de rábano picante (HRPO). El conjugado enzimático no unido se aspira y las esferas se lavan. A continuación, se añade a las  esferas  una solución de o-fenilendiamina (OPD), que contiene peróxido de hidrógeno. Después de la incubación, se obtiene un color amarillo anaranjado, cuya intensidad es proporcional a la cantidad de anticuerpos frente al VIH-1 y/o  VIH-2 unidos a las esferas. Las muestras cuyos valores de absorbancia sean inferiores al valor del punto de corte se consideran como negativas para los anticuerpos y no son necesarios análisis ulteriores. Las muestras repetidamente reactivas se consideran como positivas según los criterios del ensayo ABBOTT HIV-1/HIV-2 EIA PLUS DE TERCERA GENERACIÓN y se deben analizar con un ensayo suplementario (Abbott, 1994).

 3.1.2. Procedimiento de la técnica elisa para detección de anticuerpos contr el VIH:

 Es muy importante tener los reactivos de los kits 15 minutos en temperatura ambiente antes de ser utilizados en el procedimiento del elisa (enzimoinmunoensayo) para la detección de los anticuerpos en contra del VIH.  Los pasos a seguir para realización de este ensayo son los siguientes:

1. Se sirven (3) controles negativos 150µl y (2) controles positivos 150µl.
2. Se sirven los sueros de los donantes (150µl) (Figura No.2).
3. Se dispensa  el diluyente de muestra (50µl) en cada pozo que contenga un control o una muestra (Figura No.3).
4. Se añade una esfera del antígeno VIH-1/VIH-2 en cada pozo que contenga un control o una muestra (Figura No.4).
5. Se coloca el adhesivo  a la bandeja para que en la incubación no exista evaporación ni tampoco contaminación de una muestra con otra. Golpear las placas para mezclar las muestras y las esferas y para eliminar las burbujas de aire que hayan quedado atrapadas (Figura No.5).
6. Se lleva a incubar por 30 minutos a 40°C con agitación (Figura No.6).
7. Se retira el adhesivo. Se aspira el liquido  y lavar cada esfera con agua destilada o desionizada hasta obtener un volumen total de agua de lavado de 12ml A 18ml.
8. Se lleva al COMMANDER para  agregar  200µl a cada pozo de conjugado diluido (Figura No.7).
9. Se entran los datos de las muestras (sacando los 5 controles) y se coloca el numero de lote del kit.
10. Al salir la bandeja, se coloca un adhesivo nuevo.
11. Se vuelve a incubar por 30 minutos con agitación a 40°C.
12. Se retira el adhesivo.
13. Se prepara una bandeja con menos pozos (muestras blanco) con sus respectivas esferas blanco y el OPD para calibrar tanto el lavado como  la absorbancia de las muestras (Figura No.8).
14. Se coloca primero la bandeja de los blancos en el COMMANDER y al salir se observa la calidad del lavado y el punto de corte (cut off).
15. Al estar listo, se coloca la bandeja al COMMANDER, para ser lavados  y extraer lo que no reacciono de los antígenos de VIH. Al ser lavado cada pozo queda la perla con los anticuerpos adheridos, según el caso.
16. Se agrega el OPD  (el revelado) 300µl en cada pozo (Figura No.9).
17. Se agrega H₂SO₄ 1N, 300µl a cada pozo y el aparato va realizando la absorbancia de cada muestra.
18. Análisis de cada pozo y del resultado de la absorbancia (punto de corte).

4. METODOLOGIA

De las muestras que resultaban reactivas inicialmente, se les volvía a realizar el test por duplicado y finalmente a las ultimas que  salieron reactivas esas 3 veces se les manda a  realizar una prueba confirmatoria de western blot. Cabe mencionar que según normas de procedimiento del banco de sangre solamente se realiza una vez la prueba confirmatoria, western blot, a cada una de las muestras repetidamente reactivas mediante el ensayo elisa; y si el resultado de la prueba confirmatoria es indeterminado se deja como falso positivo; ya que por problema de costos y la situación que actualmente pasan los hospitales en Colombia, no existe presupuesto para seguir este tipo de estudios a un nivel más profundo. Es importante mencionar que, por norma, el Banco Metropolitano de Sangre  de la ciudad de Bucaramanga, a estas muestras, también se les realiza la prueba de anticuerpos contra el

Tripanosoma cruzi,  agente etiológico de la Enfermedad de Chagas, y germen endémico en el oriente colombiano.

Figura No.2. Toma de muestra.

Figura No.3. Diluyente de muestra

 Figura No.4. Colocar los blancos

Figura No.5. Colocar adhesivo

Figura No.6. Incubador




Figura No.7. Commander.

Figura No.8. Colocar esferas

Figura No.9. Pipetear OPD

Respetable Jñápika Gurú Dr. Pablo Elias Gómez Posse.

E Mail: aum_jnapika_satya_guru@hotmail.com
 

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